双特异性抗体（BsAbs）因其可同时靶向两个不同抗原表位的特性，在肿瘤免疫治疗等领域展现出显著治疗潜力。然而，其复杂的异源二聚体结构在生产过程中易产生多种片段杂质，主要包括同源二聚体、半抗体（单臂抗体）、低分子量降解片段及高分子量聚集体。这些杂质会显著影响药物的生物活性、稳定性、安全性和药效，甚至引发免疫原性风险。因此，开发高效、特异的纯化工艺以去除片段杂质，是双抗药物成功研发与产业化的核心环节。

双特异性抗体（BsAbs）因需组合两条不同重链（HC）和两条不同轻链（LC），在生产中因一些因素（如二硫键的减少及剪切力），导致错配或组装不完整产生三类典型杂质： 

图1. bsAb产品相关杂质的示意图[1]

片段bsAb杂质纯化策略 

针对上述主要杂质类型，需采用基于理化性质差异的多步骤层析分离策略：

图2. 双抗纯化策略

如上一篇关于聚集体去除的文章所述，聚集体和片段因含有Fc结构域，可与Protein A特异性结合，其结合-洗脱特性与目标双抗分子相似。鉴于不同分子与Protein A的结合强度存在差异，可通过优化洗脱pH条件，选择性去除结合较弱的片段[2]。以UniMab 50HC亲和层析纯化某双抗为例（图3）：在pH 5.5条件下，半抗及片段被洗脱；而在pH 5.0和pH 4.5条件下，分别洗脱下完整双抗和双抗聚集体。

图3.UniMab 50HC亲和纯化某双抗
 

Protein L亲和层析介质可特异性结合bsAb的轻链区域。值得注意的是，部分双抗片段对Protein L的亲和力显著高于完整bsAb。通过提高洗脱缓冲液的pH值，可有效降低低分子量杂质的洗脱比例。采用NMab Prot L亲和层析介质，通过步级pH洗脱实现目标双抗的高效分离——完整bsAb在特定pH条件下被选择性洗脱，而低分子量双抗片段则因结合力较强而保留在介质上。最终通过在位清洗（CIP）程序彻底去除残留杂质，确保产品纯度，收率达到80.3%（图4）。

图4. NMab ProtL亲和层析去除半抗及其他片段杂质

在双抗纯化中，针对双抗片段难去除问题，可采用UniGel-30CM弱阳离子交换层析，通过调控pH和盐浓度梯度，使带电较弱的片段优先洗脱。添加一定浓度的PEG或CaCl₂可提升分辨率，实现双抗单体纯度99%、收率80%以上（图5）。

图5. UniGel-30CM阳离子交换层析纯化双抗

疏水相互作用在抗体片段的去除中应用颇为广泛。一般而言，相较于结构完整、折叠紧密的BsAb，片段杂质由于缺乏完整的配对结构（如缺失一条轻链或重链），导致其分子内部原本被包埋的疏水区域暴露出来，与疏水层析介质的结合力更强。采用UniHR Phenyl-30L,采用盐浓度步级洗脱，可以将大部分片段杂质有效去除，纯度提升至99.74%（图6）。

图6. UniHR Phenyl-30L疏水作用纯化某双抗

除传统离子交换与疏水层析外，复合模式层析可整合多种作用力协同分离双抗片段。

NW Rose Plus HCM HP 是一种结合弱阳离子交换与疏水作用的复合模式介质。通过优化盐浓度梯度，该介质可依据双抗片段与完整分子间的疏水及电荷差异实现高分辨率分离，高效去除目标片段杂质（图7）。

图7. NW Rose Plus HCM HP复合模式层析纯化某双抗

高效清除双抗片段是保障药物质量的关键挑战。深入理解片段杂质形成机制，针对片段杂质的特性—如亲和力差异、电荷异常、疏水区域暴露等，构建多机制协同的精纯策略，高效降低双抗片段含量。以下是双抗片段去除的填料推荐。

推荐填料

[2] Y. Wen, Y. Ye, Z. Wang, J. Xu, Z. Meng, W. Luo, Y. Zhao, Y. Fang, Removal of antibody-related fragments during asymmetric bispecific antibody purification, Asian Journal of Complementary and Alternative Medicine 13 (2025) 1-15